灌流程序在单细胞测序样本前处理中的应用：JX-DLDXB系列单细胞悬液制备仪的技术解析

一、灌流在单细胞测序前处理中的必要性

单细胞RNA测序的灵敏度已进入单分子级别，这意味着测序文库中所有的核酸物质都会被捕获并测序——包括来自外周血细胞的信号。对于肝脏、心脏等高血管化器官，灌流不彻底会导致组织内残留大量红细胞、白细胞及游离DNA，直接稀释目标细胞信号，干扰聚类分析结果。

肝脏：双重血供（门静脉+肝动脉），残留血液中混入的红细胞、Kupffer细胞、循环单核细胞会直接稀释肝实质细胞和稀有非实质细胞群在总细胞中的占比。

心脏：心腔储血、冠脉网络密布，未清除的血液不仅会引入大量红细胞和血小板，还会在聚类中形成假阳性亚群，误导差异基因筛选。

在《Nature Methods》《Cell》级别的单细胞研究中，针对肝脏、脑、心脏等高血管化器官，灌流已被视为保证测序结果可重复的必要前提。

二、JX-DLDXB系列灌流程序的技术方案

净信JX-DLDXB系列单细胞悬液制备仪将灌流程序直接内置于仪器系统中，采用标准化程序替代人工经验判断，使灌流操作从“依赖手感”变为“可程序化控制”。设备内置两种灌流模式，可根据实验需求选择。

 

模式一：原位灌流（In situ Perfusion）

器官未取出，直接在体内灌流，排血最为彻底。操作者暴露目标血管后连接灌流管路（肝脏走门静脉，心脏走左心室→升主动脉），启动仪器程序，冷缓冲液沿生理血管走向自然置换残留血液。

原位灌流对测序结果的影响主要体现在三个方面：灌流液顺血管生理方向流动，不破坏组织微结构，测序所得细胞状态真实反映体内情况而非“受伤后”的应激表达谱；排血彻底，红细胞、血小板、循环免疫细胞的清除率远高于体外冲洗；以肝脏原位灌流为例，门静脉进液、下腔静脉出液的双路程序可将细胞悬液中红细胞比例从40%以上压降至5%以内。

模式二：离体灌流（Ex vivo Perfusion）

器官取出后，在仪器腔体内完成灌流并自动衔接解离，最大限度压缩组织离体时间。取出器官后直接放入制备腔，内置管路持续灌注冲洗，灌流结束自动跳转解离程序，无需二次转移。离体灌流可完整模拟Langendorff灌流逻辑，实现主动脉逆行灌注，将冠脉系统血液清除干净，同时灌流→解离自动衔接，每缩短一分钟离体时间就减少一分细胞应激对转录组的干扰。全程标准化操作确保不同批次、不同操作者之间的样本质量高度一致。

 

三、肝脏灌流的实验价值

 

        未灌流            离体灌流              原位灌流

肝脏是单细胞测序中灌流价值最为突出的器官。不做灌流直接解离的小鼠肝脏，细胞悬液中红细胞占比常超过40%，意味着近一半的测序reads被消耗在不感兴趣的红细胞上。而肝星状细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞等在总细胞中占比本就处于个位数水平，被大量红细胞“稀释”后极易被聚类算法当作噪声过滤掉。

使用JX-DLDXB系列的处理流程如下：

① 设定灌流参数 → ② 门静脉插管启动原位灌流（肝脏逐渐褪色变白）/ 或取出肝脏放入腔体启动离体灌流 → ③ 程序自动切换至解离 → ④ 酶解联合解离 → ⑤ 碎片去除 → ⑥ 终止反应 → ⑦ 获得高纯度悬液。

 

四、心脏灌流的实验价值

心脏单细胞测序是所有组织类型中样本质量差异最大的场景之一。心肌细胞个体巨大、不耐酶消化；心脏含血量极高；心肌细胞对缺氧极其敏感，离体超过15分钟转录组基线即开始偏移。

未灌流直接解离的主要风险包括：悬液中红细胞与血小板占比可突破50%，测序reads大量浪费；心肌细胞缺氧应激导致差异基因表达被扭曲，测序结果无法反映体内真实状态；稀有心脏成纤维细胞、心内膜细胞群被血液噪声淹没。

 

五、从灌流到测序的质量控制链路

单细胞测序的全链路中，每一环都在引入变异。灌流是整条链上最靠前、最基础的环节：

灌流（程序化控制）：清除血液，确定细胞纯度下限

酶解与仪器解离：充分解离，保护细胞完整性

碎片去除与终止：去除碎片，裂解残红，提升悬液质量

文库构建与测序：样本质量决定有效reads占比

生信分析：干净的样本决定真实的聚类与可信的生物学结论

 

六、总结

单细胞测序结果的可靠性不仅取决于测序深度和降维算法，样本制备的质量才是决定测序结果可信度的基础。灌流作为制备流程的第一步，为整个实验的可靠性奠定了基础。

净信JX-DLDXB系列单细胞悬液制备仪通过内置的标准化灌流程序，将灌流操作从依赖经验的手工操作转化为可程序化控制、可重复的标准化流程。其原位灌流与离体灌流两种模式，可分别满足肝脏、心脏等高血管化器官在单细胞测序前处理中的不同需求，为测序数据的可靠性提供前处理环节的质量保障。