单细胞水平基因表达定量分析：µ-Pattern ibiTreat实验方案

同一细胞群体中的不同个体，在形态、基因表达水平乃至分化状态上往往存在显著差异。若在实验中只取群体平均信号，这种"细胞间异质性"会被一平均而掩盖，得出的结论也可能与真实的单细胞行为相悖。因此，越来越多的研究者主张：在关键实验中应当追踪并分析单个细胞，而不是对整群细胞求平均。

 

ibidi的µ-Pattern ibiTreat技术，正是为这一需求而生：它在通道表面预先制备出限定尺寸、规则排布的黏附位点，使单个细胞被"捕获"并长期固定在各自的位点上，从而允许研究者在数小时乃至数十小时的尺度上反复观察、追踪同一个细胞。该图案化表面还可根据所用细胞系灵活搭配不同的蛋白包被。

 

本实验方案，以HuH7细胞+层粘连蛋白LN521包被+eGFP mRNA转染为完整示例，系统给出从蛋白包被、细胞接种、转染、显微成像到单细胞荧光信号分析的全部关键步骤，可作为搭建"单细胞基因表达动力学"实验的操作底稿。

 

1 材料与试剂

 

1.1 细胞与试剂

• HuH7（JCRB细胞库 - JCRB0403）

• 包被蛋白：层粘连蛋白（Laminin，BioLamina，LN521-02）

• 转染试剂：

◦ OptiMEM（Gibco，11085-021）

◦ Lipofectamine 2000（ThermoFisher，11668027）

◦ mRNA（实验室自行制备，编码eGFP的mRNA）

• 其他：

◦ 不含酚红的Leibovitz L-15培养基（ThermoFisher，21083027）

◦ 无菌PBS

◦ 无菌水

 

1.2 培养基

• RPMI 1640培养基，含GlutaMAX添加剂（ThermoFisher，61870036）：

◦ 10%胎牛血清FBS（ThermoFisher，10437028）

◦ 5 mM HEPES（ThermoFisher，15630080）

◦ 1 mM丙酮酸钠（ThermoFisher，11360039）

 

1.3 设备

• μ-Slide VI ^0.4 μ-Pattern ibiTreat, sqr30, pit75, hex（ibidi，83611）

• 显微镜：Nikon TI Eclipse

 

 

2 实验步骤

提示：实际使用的细胞接种量与蛋白包被浓度，需依据所用细胞系和可用图案面积进行调整。

 

2.1 通道包被

建议每单位面积的蛋白质用量为2–5 µg/cm²。

1.用无菌PBS稀释层粘连蛋白，配制浓度为20 μg/ml的工作液。

2.用无菌PBS冲洗通道。

3.排空通道，加入30 μl包被工作液。

4.将载玻片置于37°C孵育1小时。

5.用无菌PBS多次洗涤（每次1 ml PBS，至少3次），随后进行细胞接种。

 

2.2 细胞接种

1.用细胞培养基置换通道内的PBS：每次使用150 µl培养基，重复2次，确保PBS被完全替换为细胞培养基。

2.消化收集细胞，用细胞培养基重悬，调整浓度至5×10⁵个细胞/ml。

3.向每个通道加入50 µl细胞悬液（即2.5×10⁴个细胞）；从对侧鲁尔接口吸去多余培养基。将载玻片放入培养箱，37 °C孵育1小时（不同细胞系、不同包被条件下，该时间需相应调整）。

4.轻轻移动载玻片，在显微镜下检查细胞贴壁情况。若细胞已就位、不再漂移，则用150 µl细胞培养基轻柔洗涤通道。

5.继续于37 °C孵育1–2小时，直至细胞完全贴附于图案位点。

 

 

图1：使用10×物镜对μ-Slide VI ^0.4 μ-Pattern ibiTreat, sqr30, pit75, hex的一个完整通道进行拼接成像。细胞在通道内均匀分布，且每个图案点上大多仅黏附一个细胞。图像于培养30小时后采集。

 

2.3 细胞转染

在接下来的步骤中，转染试剂的配置需满足每个通道最终50 ng的mRNA，总体积为50 µl。

1.细胞贴壁后，用150 μl OptiMEM轻轻洗涤每个通道。

2.置于37°C孵育1小时。

3.再次用150 μl OptiMEM洗涤。

4.配制转染混合液。

将mRNA（储液浓度1 μg/μl）用无菌水稀释至0.1 μg/μl。配制以下两种溶液：

• 混合液A：2 μl Lipofectamine 2000 + 398 μl OptiMEM，室温孵育5分钟

• 混合液B：98 μl OptiMEM + 2 μl mRNA（0.1 μg/μl）

将100 μl混合液B与100 μl混合液A混合，室温孵育20分钟。

5.用移液器将50 µl转染混合液移入通道中。

6.将转染混合液与细胞在室温下孵育1小时。

7.用L-15培养基洗涤两次。

8.若在无CO₂条件下进行成像，加入100 μl L-15培养基；若具备CO₂气体孵育条件，则使用不含酚红的标准细胞培养基。

 

2.4 显微图像采集

1.将载玻片置于显微镜载物台上。

2.使用10×物镜。

3.在通道内预先定义多个拍摄位置。

4.每10分钟采集明场及所需荧光通道（GFP通道）图像，持续时间最长可达30小时。

 

图2：10×物镜下，荧光信号在0、3、6、9、12、15小时的延时成像序列。随着时间推移，信号强度逐渐增强，表达eGFP的细胞数量也逐渐增多。

 

3 单细胞荧光信号分析

借助µ-Pattern的物理限定位点，细胞的水平运动被显著限制，因此可以相对容易地在明场图像上完成对"同一细胞"的跨时间追踪，并提取其随时间变化的荧光强度。由此，可针对每一个单细胞分别测定其荧光强度以及对应的基因表达动力学参数，而不再依赖群体平均。

 

3.1 PyAMA：基于Python的自动化微结构分析

荧光报告基因的表达分析可借助开源软件PyAMA自动完成。PyAMA全称为 "Automated Microstructure Analysis in Python"，是一款基于Python的应用程序，用于显示和读取由延时荧光显微镜采集的TIFF图像堆栈中单个细胞的荧光时间序列。该软件开源，可在GitHub搜索SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama获取。

 

 

图3：使用PyAMA进行分析的截图。概览图中，所有被分析的细胞位点以绿色方框标记。图中显示了所有被分析细胞位点的荧光强度随时间变化的曲线。三个选定的曲线在概览图中以红色标出。荧光强度随时间增加。eGFP的表达及强度的增加对于每个细胞而言均具有个体差异性。

 

关于基于数学动力学速率模型对荧光时间序列进行解读的详细方法，可参阅以下文献：

• Reiser A, Woschee D, Kempe SM et al. (2021) Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) – a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. 169: e62025, doi: 10.3791/62025

 

• Judith A. Müller, Nathalie Schäffler, Thomas Kellerer, Gerlinde Schwake, Thomas S. Ligon, Joachim O. Rädler "Kinetics of RNA-LNP delivery and protein expression" (2024) European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 197, 114222, doi: 10.1016/j.ejpb.2024.114222

 

写在最后

与微流控芯片、荧光激活细胞分选（FACS）等经典单细胞分析平台相比，µ-Pattern技术的工程门槛显著降低：研究者无需自建昂贵的微流控系统，亦不必在实验前进行单细胞分选，仅需一块预图案化载玻片配合常规细胞培养与显微成像流程，即可获得可跨时间追踪、可逐一定量的单细胞长时程观测数据。

 

在科学问题层面，这一优势使其尤其适用于以下方向：单细胞基因表达动力学、药物响应的细胞间异质性，以及RNA（如mRNA-LNP）递送效率与后续蛋白表达动力学的定量比较。对于希望以较低成本建立单细胞时序分析能力的实验室，本方案提供了一条可直接复用的技术路径。

 

附注：本用户方案为ibidi经过同行评审、来自真实用户的实验方案。ibidi不对其功能性与可重复性作任何保证，对本方案仅提供有限支持。

适用范围：仅供科研使用（For research use only），不得用于临床诊断或治疗。