小鼠皮下移植瘤单细胞悬液快速制备及酶解方案

一、皮下瘤单细胞制备的难点

皮下移植瘤模型广泛用于肿瘤免疫研究，流式分析CD8+T细胞功能与细胞极化状态对单细胞悬液质量要求极高。然而，肿瘤微环境具有以下特点：

致密纤维结构多：胶原纤维和细胞外基质丰富，传统酶解难以渗透；

细胞脆弱：肿瘤细胞及浸润免疫细胞对机械力和酶解时间敏感，易损伤；

批次差异大：手工操作难以标准化，导致实验重复性差。

传统摇床消化或手工研磨方法往往消化不均匀、活率偏低，且无法批量处理多只小鼠样本。

 

二、设备与试剂

设备：净信单细胞悬液制备仪

加热套（用于消化管恒温控制）

70 μm细胞滤网、50 ml消化管、眼科剪、离心机

试剂：

肿瘤组织解离酶（配套酶离者系列，干粉或液体，-20℃保存）

酶解终止液

PBS（无菌）

DPBS（重悬用）

 

三、实验操作流程

1. 仪器准备与程序设定
连接单细胞悬液制备仪电源，开机后选择“小鼠肿瘤”程序备用。设备预存该程序，确保消化参数标准化。

2. 试剂解冻
将肿瘤组织解离酶与终止液提前从-20℃取出，用流动自来水（凉水）解冻至室温，充分混匀。

注意：严禁使用温热水解冻，以免酶蛋白变性失活。

3. 组织取材
断颈处死小鼠，无菌操作取出皮下移植瘤（约1 g），置于含PBS的培养皿中，用PBS洗涤去除血液及红细胞，确保组织干净。小鼠建议现杀现用，离体时间尽量缩短。

4. 预剪碎（关键步骤）
用眼科剪将肿瘤组织剪至糊状（约1–2 mm³大小），转移至50 ml消化管中，加入适量肿瘤组织解离酶。组织越碎，酶解越快越均匀。

5. 程序化消化
将消化管放入设备通道，套上加热套（维持酶最适温度，确保恒温消化）。选择对应通道模块，点击运行。设备自动完成消化过程，计时结束后自动停止。运行过程中可适时取下加热套观察消化程度，防止过度消化。

6. 终止与过滤
消化完成后，用70 μm细胞滤网过滤消化液，去除未消化组织块。按消化液 : 终止液 = 1 : 1 的体积比加入终止液，充分混匀以快速中和酶活性。

7. 离心与重悬
过滤液离心（建议300×g，5分钟），弃上清。加入少量无菌DPBS，轻柔吹打重悬沉淀，即得单细胞悬液。

8. 细胞计数与活率检测
取少量悬液，使用自动细胞计数仪（如AOPI染色）检测细胞活率及浓度。本次实验活率达93%。

 

四、实验结果

 

经上述流程处理，镜检显示单细胞悬液分散良好，无明显细胞团块，碎片少。细胞计数仪检测活率为93%，满足流式细胞术分析CD8⁺ T细胞功能及细胞极化的样本要求。

五、操作注意事项

1.试剂保存与解冻：单细胞试剂盒应-20℃低温保存。使用前用凉水流水解冻，严禁温热水，避免酶蛋白变性。

2.组织新鲜度：小鼠建议现杀现用；如需转运，尽量缩短离体时间，降低细胞活力损失。

3.预剪碎充分：上机前将肿瘤剪至糊状，可显著加快酶解速度，提高单细胞获得率。

4.消化终点判断：运行中途可暂停观察，一旦组织块基本分散、细胞游离均匀即可停止，防止过度消化损伤细胞。

5.离心洗涤控制：离心洗涤次数不宜过多（建议1-2次），时间不宜过长，以免机械性损伤细胞。

 

六、同类产品参数对比

对比项	净信单细胞悬液制备仪	传统摇床+手工消化
通量	4通道独立并行	单管或少量
温度控制	加热套恒温，精准控温	水浴锅，温度波动大
程序化	内置肿瘤专属程序，自动化	人工计时，批次差异大
消化均一性	高	较低
细胞活率	≥90%（实测93%）	通常70-85%
人力占用	无需值守	需全程监控

 

七、适用肿瘤/组织类型拓展

该方案及设备已覆盖20余种组织类型，包括但不限于：

皮下移植瘤（肝癌、肺癌、乳腺癌等）

原位肿瘤模型

淋巴结、脾脏

脑胶质瘤

肝、肾、肺等实体器官

设备内置多种物种及组织专属程序，可根据实验需求灵活切换。

 

八、总结

本文建立了一套基于程序化单细胞悬液制备仪及配套肿瘤组织解离酶的小鼠皮下瘤单细胞悬液高效制备方案。通过预剪碎、加热套恒温消化、程序化自动运行、精准终止等步骤，实现了高活率（93%）、高重复性的单细胞悬液制备，满足流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞的下游实验要求。该方法同样适用于其他实体肿瘤及多种组织类型，为肿瘤免疫研究提供了可靠的前处理工具。