单细胞悬液制备仪在多种植物原生质体制备中的应用

一、实验背景

植物单细胞测序、瞬时转化及蛋白互作等研究，均以高质量原生质体为起始材料。植物细胞外层包裹坚韧细胞壁，纤维素与木质素结构复杂，原生质体制备难度较高。传统手工酶解需要撕除表皮、长时间孵育并手动轻摇，操作环节多、耗时长，且批次间重复性受操作者影响较大。部分农作物与木本植物样本因细胞壁结构更为致密，手工法制备合格原生质体的难度进一步增加。

针对上述问题，本实验采用净信JX-CKSM单细胞悬液制备仪，利用仪器恒温、程序化运行与磁珠辅助酶解协同的方式，对多种植物样本进行原生质体制备，并对制得原生质体的完整性与活性进行镜检评估。

二、材料与方法

2.1 实验样本

葡萄叶片、玉米籽粒、毛桃根、结缕草叶片。

2.2 设备与试剂

单细胞悬液制备仪JX-CKSM；植物解离酶；W5溶液；消化管；手术刀；细胞滤网；4℃水平离心机；显微镜及荧光染色试剂。

2.3 实验流程

1. 仪器预热：仪器设置40℃，待温度稳定后开始实验。

2. 样本取材与切割：无需撕除表皮，使用手术刀将植物组织横向、纵向切割为细小碎块或细条。

3. 自动酶解消化：将组织碎块放入消化管，加入植物解离酶，放置于仪器中，选择对应程序自动完成消化。

4. 终止与过滤纯化：酶解结束后加入等体积W5溶液终止反应，经滤网过滤去除未消化组织残渣。

5. 离心洗涤：使用4℃水平离心机离心，弃上清，以W5溶液重悬洗涤。

6. 镜检评估活性：采用显微镜明场观察与荧光染色，评估原生质体完整度与细胞活性。

三、实验结果

镜检结果显示，玉米籽粒、毛桃根、葡萄叶片及结缕草叶片四种样本均成功解离获得完整原生质体。荧光染色显示细胞活性良好，背景碎片与杂质处于可控范围。制备所得原生质体可直接用于后续单细胞测序、原生质体转化等下游实验。

从样本类型来看，叶片、根、籽粒等不同植物组织均可通过该流程完成原生质体制备，表明该方法在植物组织类型上具有一定的适用性。

四、设备与技术特点

1. 前处理流程简化

无需撕除植物表皮，组织经手术刀切碎后即可上机，减少前处理时间与人为操作带来的样本损伤。

2. 磁珠与酶协同解离

高密度氧化锆磁珠提供温和物理辅助，配合植物解离酶协同降解细胞壁。与剧烈破碎方式相比，该方式在解离组织的同时，有助于保护原生质体细胞膜完整性，减少细胞破损。

3. 恒温控制与程序化运行

仪器温度范围22–56℃可调，可根据植物酶解需求设置适宜温度，全程恒温运行。内置多套程序，一键启动后自动运行，减少手工晃动与温度波动带来的批次差异，提高实验重复性。

4. 样本兼容性

除葡萄、玉米、毛桃、结缕草外，该流程还可用于拟南芥、棉花、水稻等植物叶片、根及籽粒组织。更换程序与试剂后，也可用于动物组织单细胞悬液制备。

5. 下游实验对接

制备完成的原生质体经纯化洗涤后，可用于单细胞RNA测序、瞬时基因转化、原生质体融合、流式细胞分析及蛋白亚细胞定位等实验。

五、操作注意事项

1. 仪器需提前预热至设定温度并保持稳定后再开始实验。

2. 植物组织切割应尽量均匀，以增加酶液与组织的接触面积。

3. 酶解结束后及时加入W5溶液终止反应，避免过度消化。

4. 离心与洗涤步骤建议在4℃条件下进行，以减少原生质体损伤。

5. 不同植物样本的细胞壁结构存在差异，首次实验建议对酶解时间与程序参数进行预实验优化。

六、总结

植物原生质体制备是植物单细胞研究的前处理环节，样本质量直接影响下游实验的可行性。本实验采用JX-CKSM单细胞悬液制备仪，对葡萄叶片、玉米籽粒、毛桃根及结缕草叶片四种样本进行原生质体制备，均获得形态完整、活性良好的原生质体。仪器辅助酶解与程序化恒温运行的方式，将传统手工酶解中依赖操作经验的环节转化为可重复的流程，为植物单细胞研究提供了一种可供参考的前处理方案。