基于μ-Pattern ibiTreat的T细胞介导肿瘤细胞杀伤实验方案

导语

免疫治疗已成为肿瘤临床研究的热点方向之一，其疗效高度依赖T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。如何建立高通量、统计稳健的体外杀伤评价体系，是筛选工程化T细胞、评估免疫检查点阻断策略的关键环节。

 

本文基于ibidi μ-Pattern ibiTreat微图案载玻片，系统介绍一篇T细胞介导的肿瘤细胞杀伤实验方案。该方案利用微图案化芯片技术，在单次实验中实现多条件平行筛选与多重复独立数据采集，为CAR-T/TCR-T细胞功能评估及免疫检查点研究提供了统计稳健的技术路径，供从事肿瘤免疫学研究的同行参考。

 

一、研究背景与平台概述

免疫疗法通过利用T细胞强大的肿瘤细胞杀伤能力，已彻底改变了临床肿瘤学格局。其中，单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路，以及通过CAR或TCR工程化改造T细胞，是提高抗肿瘤免疫应答的关键策略。为筛选最有效的T细胞制品并评估免疫检查点阻断的增效作用，亟需一种兼具高通量与统计稳健性的体外筛选平台。

 

μ-Pattern ibiTreat正是这样一种高通量筛选平台，其微结构表面形成大量独立的封闭反应区室，允许在单次实验中设置多次重复，确保数据的统计可靠性。本文详细描述了利用该平台进行肿瘤细胞与T细胞共培养杀伤实验的标准工作流程，以及相应的图像采集与数据分析方法。

 

二、材料与试剂

2.1 细胞株与试剂

• RCC-26与RCC-53细胞：人肾细胞癌（ccRCC）贴壁细胞系，源自不同患者的原发肿瘤组织（慕尼黑亥姆霍兹中心建系）。

• TCR53/CD8-T细胞：逆转录病毒转导的人原代T细胞，表达HLA-A2限制性、抗原特异性TCR53，可识别RCC-26和RCC-53细胞。

• I型胶原蛋白，大鼠尾部来源（ibidi，50201）

• 抗PD-1抗体（BioLegend，329926）

• 抗PD-L1抗体（BioLegend，329716）

• PBS（Gibco，14190-094）

• 0.01 M盐酸（Merck，109057）

 

2.2 培养基

• RPMI 1640（Gibco，31870），补充：

◦ 10%胎牛血清（FCS，Anprotec，AN-S006G）

◦ 1%青霉素/链霉素（Gibco，15140-122）

◦ 2 mM L-谷氨酰胺（Gibco，25030）

◦ 1×非必需氨基酸（Gibco，11140-035）

◦ 1 mM丙酮酸钠（Gibco，11360-039）

2.3 设备

· •µ-Slide 8 Well ^high µ-Pattern ibiTreat, cir200, pit600, hex (ibidi, 83812)

•显微镜：明场，4×物镜，自动载物台

•载物台培养箱(37°C，5% CO₂，ibidi Stage Top Incubator, 12722)

·

 

2.4 实验背景信息

RCC-26与RCC-53均为透明细胞肾细胞癌（ccRCC）细胞系，但生物学行为不同：RCC-26来源于分化良好、体积较小、早期未转移的原发肿瘤；RCC-53则来源于去分化、体积较大、晚期且已发生多器官转移的肿瘤。

 

TCR53/CD8-T细胞经转导后表达TCR53及CD8共受体，对两种肿瘤细胞均具有HLA-A2限制性识别能力，可诱导细胞因子释放和细胞毒性。

 

在肿瘤微环境中，T细胞常出现功能丧失，部分归因于PD-1/PD-L1抑制通路的激活。为探究该通路对杀伤效力的影响，可加入抗PD-1和抗PD-L1抗体进行阻断实验。

 

三、操作步骤

3.1 孔板包被

肿瘤细胞需保持活力并牢固贴壁，适宜的包被条件至关重要。不同细胞类型需优化包被蛋白种类、浓度、包被时间及洗涤步骤。对于本实验使用的RCC细胞系，推荐如下：

 

1.以0.01 M盐酸将I型胶原蛋白稀释至10 μg/ml。

2.每孔加入150 μl胶原蛋白包被液。

3. 37 °C孵育1小时。

4.以300 μl无菌PBS洗涤5次。

 

注意：部分细胞可能直接贴附于ibiTreat表面，这可能改变细胞行为并影响杀伤评估，故包被条件需预实验确定。

3.2 肿瘤细胞接种

接种密度应使图案区域内形成均匀的单层细胞，避免过密或堆叠生长。需针对不同细胞类型优化接种浓度、孵育时间及洗涤次数及步骤。对于RCC-26和RCC-53：

 

1.最佳接种浓度：2.5×10⁴细胞/mL（RCC为大细胞）。

2.每孔加入300 μL细胞悬液。

3.于37°C培养5小时促进贴壁。

4.用300 μL培养基小心洗涤3次，去除未贴壁细胞。

5.显微镜下检查细胞汇合度。

 

通常在初始贴壁及洗涤后，继续于37°C培养12–16小时，可获得理想的单层汇合。

 

3.3 T细胞的加入

肿瘤细胞形成汇合单层后，加入T细胞启动杀伤实验。建议设置不含T细胞的对照孔，以监测自发细胞死亡或其他非特异性变化。此外，可设置不被T细胞识别的肿瘤细胞作为阴性对照。

 

1.配制以下T细胞悬液（均用培养基稀释）：

a) 2.5 × 10⁴细胞/mL的T细胞

b) 2.5 × 10⁴细胞/mL的T细胞，并添加抗PD-1和抗PD-L1抗体各20 μg/mL

c) 不含T细胞的培养基（对照）

 

2. 将各孔原有培养基更换为300 μL对应的T细胞悬液或对照培养基。

 

注意：操作应迅速，避免细胞在孔底干燥。

 

3.4 显微图像采集

建议在加入T细胞前预先选定成像位置，以捕捉早期杀伤事件。选择细胞汇合度接近100%、呈单层无重叠的区域。实验持续时间与成像间隔需根据细胞类型及杀伤速率调整。

 

1.将载玻片置于配备培养箱的显微镜上，设定37°C、5% CO₂。

2.每孔设定至少2个成像位置，每个位置包含多个图案（使用4×物镜及200 μm图案时，通常可观察到4–5个图案）。

3.前3小时以10分钟间隔采集明场图像；之后间隔延长至2小时，总观察时间3天（75小时）。

 

四、杀伤效力定量评估

杀伤效力通过分析共培养期间各时间点图案区域的细胞汇合度（覆盖率）来评估。从T细胞加入时（t=0）选取汇合度接近单层的图案开始追踪，每种条件分析9个独立图案。

 

示例结果（见图1及图2）

• 对照组（无T细胞）：RCC-26或RCC-53均保持接近100%汇合度，无显著下降，表明无T细胞非依赖性死亡。

• RCC-26 + TCR53/CD8 T细胞：汇合度迅速下降，07:40小时后<50%，35:40小时后图案完全清空。

• RCC-53 + TCR53/CD8 T细胞：汇合度下降缓慢，49:40小时后仍约50%覆盖率。

• RCC-53 + TCR53/CD8 T细胞 + 抗PD-1/PD-L1抗体：汇合度下降加快，35:40小时后约50%，但仍慢于RCC-26组。

 

结论：相同T细胞对RCC-26的杀伤效率显著高于RCC-53；加入检查点阻断抗体可提高对RCC-53的杀伤，但未达到对RCC-26的水平。

 

 

图1. TCR53/CD8 T细胞与RCC-26或RCC-53肿瘤细胞共培养的延时影像。图中展示了00:40、07:40、35:40和49:40小时后的示例图像。

•第一行：RCC-26对照（无T细胞），汇合度维持。

•第二行：RCC-26 + T细胞，细胞快速清除。

•第三行：RCC-53对照（无T细胞），汇合度维持。

•第四行：RCC-53 + T细胞，清除缓慢。

•第五行：RCC-53 + T细胞 + 抗PD-1/PD-L1，清除加速。

· 

 

图2：采用TCR53/CD8 T细胞和RCC-26或RCC-53肿瘤细胞系进行的T细胞介导的杀伤实验。基于细胞图案区域汇合度的杀伤效力分析。（每种条件下均评估了9个独立样本，并计算了均值及其标准差。）

•红色实线：RCC-26 + T细胞（快速下降）。

•蓝色实线：RCC-53 + T细胞（缓慢下降）。

•黄色虚线：RCC-53 + T细胞 + 阻断抗体（介于两者之间）。

 

五、结论

本实验观察到同一T细胞群体对不同肿瘤细胞系的杀伤效力存在显著差异。在此示例中，相同的TCR53转基因T细胞对RCC-26的杀伤效率远高于对RCC-53的杀伤效率。同时证实，通过添加检查点阻断抗体（抗PD-1/抗PD-L1）可进一步提升杀伤效力。

上述结果证明，μ-Pattern ibiTreat载玻片非常适用于作为T细胞介导杀伤实验的高通量平台。其多孔设计使得在单次实验中即可研究多种条件，例如不同的肿瘤细胞系、不同的培养基补充剂或不同的T细胞。通过多阵列形式，每种实验条件均包含多个图案重复样本，可收集独立数据以支持统计学评估。

 

参考文献

•Baumeister, S. H., G. J. Freeman, G. Dranoff, and A. H. Sharpe. 2016. 'Coinhibitory Pathways in Immunotherapy for Cancer', Annu Rev Immunol, 34: 539-73.

 

•Blohm, U., E. Roth, K. Brommer, T. Dumrese, F. M. Rosenthal, and H. Pircher. 2002. 'Lack of effector cell function and altered tetramer binding of tumor-infiltrating lymphocytes', Journal of Immunology, 169: 5522-30.

 

•Djafarzadeh, R., E. Noessner, H. Engelmann, D. J. Schendel, M. Notohamiprodjo, I. von Luettichau, and P. J. Nelson. 2006. 'GPI-anchored TIMP-1 treatment renders renal cell carcinoma sensitive to FAS-meditated killing', Oncogene, 25: 1496-508.

 

•Fischbeck, A. J., S. Ruehland, A. Ettinger, K. Paetzold, I. Masouris, E. Noessner, and A. N. Mendler. 2020. 'Tumor Lactic Acidosis: Protecting Tumor by Inhibiting Cytotoxic Activity Through Motility Arrest and Bioenergetic Silencing', Front Oncol, 10: 589434.

 

•Frankenberger, B., E. Noessner, and D. J. Schendel. 2007. 'Immune suppression in renal cell carcinoma', Semin Cancer Biol, 17: 330-43.

 

•Frey, A. B., and N. Monu. 2006. 'Effector-phase tolerance: another mechanism of how cancer escapes antitumor immune response', Journal of Leukocyte Biology, 79: 652-62.

 

•Gajewski, T. F., Y. Meng, and H. Harlin. 2006. 'Immune suppression in the tumor microenvironment', J Immunother, 29: 233-40.

 

•Leisegang, M., A. Turqueti-Neves, B. Engels, T. Blankenstein, D. J. Schendel, W. Uckert, and E. Noessner. 2010. 'T-cell receptor gene-modified T cells with shared renal cell carcinoma specificity for adoptive T-cell therapy', Clin Cancer Res, 16: 2333-43.

 

•Prinz, P. U., A. N. Mendler, I. Masouris, L. Durner, R. Oberneder, and E. Noessner. 2012. 'High DGK-α and disabled MAPK pathways cause dysfunction of human tumor-infiltrating CD8+ T cells that is reversible by pharmacologic intervention', J Immunol, 188: 5990-6000.

 

•Schietinger, A., M. Philip, V. E. Krisnawan, E. Y. Chiu, J. J. Delrow, R. S. Basom, P. Lauer, D. G. Brockstedt, S. E. Knoblaugh, G. J. Hämmerling, T. D. Schell, N. Garbi, and P. D. Greenberg. 2016. 'Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis', Immunity, 45: 389-401.

 

•Sharma, P., S. Goswami, D. Raychaudhuri, B. A. Siddiqui, P. Singh, A. Nagarajan, J. Liu, S. K. Subudhi, C. Poon, K. L. Gant, S. M. Herbrich, S. Anandhan, S. Islam, M. Amit, G. Anandappa, and J. P. Allison. 2023. 'Immune checkpoint therapy-current perspectives and future directions', Cell, 186: 1652-69.

 

•Waldman, A. D., J. M. Fritz, and M. J. Lenardo. 2020. 'A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice', Nat Rev Immunol, 20: 651-68.

 

•Zhao, L., and Y. J. Cao. 2019. 'Engineered T Cell Therapy for Cancer in the Clinic', Front Immunol, 10: 2250.

 

附注：本实验方案源自实际使用者的实验经验，并经ibidi同行评审。ibidi不保证该方案的功能性或可重复性，且仅提供有限技术支持。

适用范围：仅限科研使用！