应用指南 | 基于ibidi 3D微孔插件的趋化性驱动侵袭实验

了解细胞侵袭对于揭示肿瘤进展和免疫细胞迁移的机制至关重要，这两者都是疾病发展和治疗反应的核心。本实验方案描述了一种利用3D微孔插件（micro-Inserts 3D for self-insertion）进行的趋化性驱动侵袭实验，该插件内填充有3D I型胶原蛋白基质，用于评估Jurkat T细胞的迁移行为。

作为快速迁移淋巴细胞的代表，Jurkat细胞被接种在胶原蛋白凝胶表面，并暴露于相邻储液池中不同浓度胎牛血清（FCS）所形成的血清梯度中。24小时后，通过成像和深度定量评估细胞向胶原蛋白基质的侵袭情况。与处于化学成分均匀环境中的细胞相比，暴露于FCS梯度中的细胞侵入深度显著更深，且该现象与血清的绝对存在量无关。

 

该实验设置模拟了三维环境中的趋化性侵袭，并突显了定向信号在促进细胞通过细胞外基质成分进行主动迁移中的作用。该检测方法为在生理相关条件下研究免疫细胞迁移与肿瘤微环境相互作用提供了可靠且可重复的平台。

1 材料

1.1 试剂与缓冲液

•3D微孔插件（micro-Inserts 3D for self-insertion）（ibidi，80499）

•共聚焦24孔培养板（μ-Plate 24 well，ibitreat）（ibidi，82426）

•I型牛胶原（Collagen Type I, Bovine）（ibidi，50303）

•Jurkat细胞（ACC 282，DSMZ GmbH）

•RPMI 1640培养基（21875034，Gibco，Thermo Fisher Scientific）

•胎牛血清（FCS，10270106，Gibco，Thermo Fisher Scientific）

•10× RPMI 1640（R1145，Sigma）

•NaOH溶液（1M，超纯水配制）

•NaHCO₃溶液（7.5%，S8761，Sigma）

•无菌超纯水

1.2 设备

•细胞培养箱（加湿，37°C，5% CO₂）

•标准细胞培养设备（无菌操作台、细胞消化试剂盒、培养瓶、配有合适吸头的移液器等）

•预冷铝珠或冰块

2 实验步骤

针对一项实验，准备三种不同的样本，每种样本均设三个重复：

1. 具有趋化因子梯度的样本（-/+）：仅在3D微孔插件的外侧孔中加入趋化因子（本实验中为10% FCS）。

2. 趋化因子均匀分布的样本（+/+）：10% FCS存在于整个样本中，即外侧和内侧孔以及凝胶基质中。

3. 不含趋化因子的样本（-/-）：既不在培养基中也不在凝胶中添加任何FCS。

图1：三种实验条件的示意图（上排（-/+）、中排（+/+）、下排（-/-））：细胞被接种在3D微孔插件内的3D胶原蛋白基质上。上排（-/+）：在3D微孔插件外孔中加入趋化因子溶液，并让细胞侵入基质1–3天（具体时间取决于细胞类型）。中排（+/+）：在3D微孔插件的内孔和外孔中均加入趋化因子溶液。下排（-/-）：未加入任何趋化因子。

2.1 样品制备

1.将九个3D微孔插件分别放入µ-Plate 24孔板的孔中。轻轻按压每个插件，以排出困住的气泡，并确保其与表面紧密接触。

2.用无菌水或PBS填满孔板上的空孔，以尽量减少孵育过程中的蒸发。

2.2 胶原蛋白凝胶制备

开始制备凝胶前，请先阅读《I型胶原蛋白说明书》。

本实验需要两种胶原蛋白凝胶混合物：

•不含血清（用于-/+和-/-样本）

•含10%胎牛血清(FCS)（用于+/+样本）

1. 根据表1配制胶原蛋白混合液（1.5 mg/ml牛胶原蛋白，可含或不含0%血清）。按表1所列顺序加入各化合物，并用移液器充分混合，操作时置于冰上以延缓凝胶化。

2. 将20 µl混合液加入每个3D微孔插件（micro-Insert 3D）的内侧孔中。为确保胶原蛋白层平整，请将移液器垂直置于孔中央。

3. 盖上培养板盖，将培养板置于培养箱中，让凝胶聚合约30分钟。

 

注意：为方便计算不同的胶原蛋白浓度，可直接使用ibidi胶原蛋白计算器（ibidi Collagen Calculator）辅助计算。

 

表1：含/不含FCS 的300 μl 1.5 mg/ml I型胶原蛋白基质的移液方案

2.3 细胞接种

1. 在凝胶聚合过程中按常规方法收获细胞。

2. 制备两份浓度均为3 × 10⁵细胞/毫升的细胞悬液：

•细胞悬液1：含无血清培养基（用于-/-和-/+样本）

•细胞悬液2：含10% FCS的培养基（用于+/+样本）

3. 将培养板从培养箱中取出，并在显微镜下确认凝胶是否完全聚合。若基质尚未完全聚合，则继续孵育10–15分钟。

4. 按以下方式向每个3D微孔插件培养板的外部孔中加入250 µl培养基：

• -/-样本：使用无血清培养基

• -/+和+/+样本：使用含10% FCS的培养基

5. 将25 µl相应的细胞悬液滴加至每个孔中的凝胶基质上方。避免移液器吸头接触凝胶基质。

6. 用盖子盖好培养板，将其放回培养箱。让细胞在凝胶中侵袭24小时。

 

3 成像

1. 24小时后，使用相差显微镜记录细胞在凝胶基质中的侵袭情况。

2. 对于每个3D微孔插件，在插件中部胶原层平整处随机选择三个XY位置。在每个位置采集Z向堆栈图像，从凝胶顶部（大部分细胞在此处处于焦平面上）向下延伸至孔底，Z向步长为13 µm。

注意：相邻图像之间的z间隔应大致等于单个细胞的直径（约8–15 µm），以确保最终图像堆栈中能捕获所有细胞。

图2：来自z堆栈的代表性帧，显示Jurkat细胞在FCS梯度（-/+）条件下侵入凝胶基质24小时的情况。在3D微孔插件内的单一位置，于不同z平面上采集了相差图像。第一张图像（0 µm）显示了位于凝胶基质顶部的细胞。在随后的图像中，只有侵入到相应深度的细胞处于焦点内。该图像使用蔡司Axio Observer Z1显微镜和40× LD Plan-Neofluar物镜采集。

4 结果评估与数据分析

为评估细胞对趋化因子FCS的侵袭反应，针对每个孔计算侵袭深度评分（depth score），该评分基于各z平面图像中处于焦平面的细胞数量，反映细胞向基质内的侵袭深度。

侵袭指数（Invasion Index）的计算公式：将每个深度h处处于焦平面的细胞数量之和（nₕ）乘以对应深度h（单位：µm），再除以所有深度内细胞的总数（N）：

图3：Jurkat细胞在FCS梯度中的趋化驱动侵袭。柱状图显示平均侵袭指数。数据表示24小时后的平均值+标准误（n = 2个独立实验，每个实验重复3次）。与FCS浓度均匀的样本中的细胞相比，暴露于FCS梯度的细胞向胶原基质中的侵袭深度显著更深。注：在此示例中，跨越多个切片的细胞仅计数一次，计数位置为细胞中心平面处于焦平面的切片。

 

5总结

这种利用3D微孔插件系统进行的趋化性驱动侵袭实验，为定量分析免疫细胞在3D胶原基质中的迁移提供了一种可靠且符合生理学原理的方法。在不同血清条件下观察到的侵袭深度差异，突显了方向性信号在细胞运动中的重要性。该实验方案非常适合用于趋化行为的比较研究，并可适应于其他细胞类型或趋化因子，以探索细胞侵袭和微环境相互作用的各个方面。

订购信息

图片	货号	品名	描述	包装规格(个/盒)
	80496	µ-Dish 35 mm,高壁，预置3D微孔插件共聚焦培养皿，ibiTreat底部处理(TC处理)	micro-Insert 3D in µ-Dish 35 mm, high ibiTreat: ready-to-use, tissue culture-treated, sterilized, individually packed	30
	80496-200	µ-Dish 35 mm,高壁，预置3D微孔插件共聚焦培养皿，ibiTreat底部处理(TC处理)	micro-Insert 3D in µ-Dish 35 mm, high ibiTreat, Bulk Box 200: ready-to-use, tissue culture-treated, sterilized, individually packed	200
	80499	3D 微孔插件	25 micro-Inserts 3D for self-insertion: in a 10 cm transport dish, sterilized, 25 per case, 1 case	25
	80499-150	3D 微孔插件	25 micro-Inserts 3D for self-insertion, Bulk Box 150: in a 10 cm transport dish, sterilized, 25 per case, 6 cases	150