细胞免疫共沉淀实验，不止三维离心冷冻研磨仪

　　染色质免疫共沉淀（ChIP）实验是一种分子生物学技术，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。ChIP技术广泛应用于转录因子、组蛋白修饰以及其他DNA结合蛋白的研究，是表观遗传学研究中不可或缺的工具。
 

 

　　01、实验步骤

　　细胞固定--细胞裂解--染色质超声破碎（关键步骤）--免疫沉淀（推荐选择经过验证的抗体）--洗涤--洗脱--反交联--DNA纯化回收

　　

　　①细胞固定：用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联，固定它们的相互作用，通常在室温下进行，时间约10 - 30分钟。之后用甘氨酸终止交联反应。

　　

　　②细胞裂解：加入细胞裂解液进行细胞裂解。如：贴壁细胞，细胞板刮下后可直接加裂解液冰上裂解；动植物细胞还需研磨后裂解，可用三维样品研磨仪、三维离心冷冻研磨仪研磨等仪器研磨破碎，研磨、裂解，均在低温下进行。
 

三维样品研磨仪 JXFSTPRP-4D


三维离心冷冻研磨仪 JXCL-6K
 

　　③超声破碎：超声破碎是非常关键的步骤之一，需要把染色质切成较小片段，片段大小一般在200 - 1000bp左右，这样便于后续操作。可用高通量声波基因组剪切仪或非接触超声波DNA打断仪进行操作。

　　

　　02、染色质超声破碎为何是关键步骤~

　　

　　1.染色质片段太小或者太大 都会导致后期PCR分析结果呈现假阴性或假阳性。

　　

　　2、染色质片段太大不利于后续测序分析。

　　

　　03、超声波破碎操作过程

　　

　　采用高通声波基因组剪切仪 或者 非接触超声波DNA打断仪 进行染色质片段破碎。

　　

　　不同的超声功率、不同的超声时间，不同的超声样本，效果都会有所不同。

　　

　　ChIP-qPCR片段集中在200-700bp，chIP-seq片段集中在150-300bp左右为佳。

　　①人全血样本，裂红后进行细胞裂解，释放染色质，然后使用高通声波基因组剪切仪进行超声破碎。样本需要打断到150-300bp左右进行后续实验，设置不同时间、不同上样量，进行梯度预实验。

　　

　　综合样品的片段长度和荧光强度、片段集中性，20μL打断25min效果佳。

　　

　　②免疫沉淀：加入特异性抗体，（推荐选择CHIP实验验证过的抗体）抗体是针对和DNA相互作用的蛋白质的，在4℃下孵育几个小时到过夜，使抗体和目标蛋白 - DNA复合物结合。随后加入可以结合抗体的磁珠或琼脂糖珠，再次孵育，使抗体 - 蛋白 - DNA复合物结合到珠子上。

　　

　　③洗涤：用洗涤缓冲液洗珠子多次，以去除非特异性结合的杂质，洗涤过程要尽量温和，避免破坏蛋白 - DNA复合物。

　　

　　④洗脱：用洗脱缓冲液把蛋白 - DNA复合物从珠子上洗脱下来，得到含有目的蛋白结合的DNA片段的溶液。

　　

　　⑤DNA纯化回收：用酚 - 氯.仿抽提和乙醇沉淀等方法，或者使用商业化的DNA纯化试剂盒，对DNA进行纯化回收，之后就可以用于后续的分析，如PCR、测序等。

　　

　　在整个染色质免疫共沉淀（ChIP）实验过程中，仪器设备的正确使用和操作条件的精确控制是实验成功的关键因素。实验中每一个细节的精确控制都是确保实验结果可靠性和重复性的基础，选择合适的机器进行前处理步骤，更能大大提高实验的效率。