Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室载玻片

　　

　　免疫荧光实验
 

　　ibidi提供了一种简单且经济高效的方案，使用一片可移除的腔室载玻片进行细胞的培养，固定和染色，无需爬片，是倒置/正置显微镜以及长期样品储存的理想选择。
 

　　本应用提供了一种使用ibidi8孔可移除腔室载玻片（80841）培养、固定和染色细胞的简单方案。培养MCF-7细胞并用福尔马*溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。
 

　　实验使用的材料和试剂：
 

　　

　　· 8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）

　　· 可移除腔室载玻片用的盖玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811）

　　· 细胞：MCF-7（CLS，300273）

　　· 细胞培养基

　　· 细胞培养试剂

　　· PBS缓冲液

　　· 福尔马林中性缓冲液，10％（Sigma，HT5011）

　　· 染色试剂

　　o  DAPI（Sigma，D954）

　　o  DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）

　　· 封片剂：Fluoroshield^TM（Sigma，F6182）

 

　　实验方案

　　

　　细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：）

 

 

　　步骤1：

　　必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用4-6x10⁴细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。

　　1.在无菌条件下，打开8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）包装。

　　2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×10⁴细胞/ ml MCF-7。

　　3. 将400微升细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。

　　4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5％CO₂下培养。细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。

　　

　　步骤2：

　　固定是染色程序的第一步。目标是将细胞，细胞形成物或组织维持在其当前状态，并在较长时间内通过化学试剂保存。

　　1.小心地吸出细胞培养基。

　　2.用PBS洗两次。

　　3.加入400μl福尔马*溶液。

　　4.在室温下孵育30分钟。

　　5.小心吸入福尔马*溶液。

　　6.用PBS洗涤三次。

　　

　　步骤3：

　　应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。

　　1.准备你的染色溶液：

　　· PBS

　　· DYE-490鬼笔环肽

　　· DAPI 1μg/ml

　　2.小心吸出PBS。

　　3.移取400μl染色溶液到每个孔中

　　4.在室温下避光孵育30分钟

　　

　　步骤4：

　　染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号

　　1.小心地吸出染色溶液

　　2.加入400μl缓冲液

　　3.小心地吸出缓冲液

　　4.重复步骤2和步骤3至少一次

　　

　　步骤5：

　　从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。

　　

　　

　　步骤6：

　　完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。

　　1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。

　　2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到安装介质上，以避免夹住任何气泡。

　　Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　3.等封片剂固定好。

　　

　　

　　步骤7：显微观察

　　

　　

　　在可移除8孔腔室载玻片中免疫染色的MCF-7细胞的荧光显微镜检查。绿色：α-微管蛋白，红色：F-肌动蛋白（鬼笔环肽），蓝色：细胞核 (DAPI)。使用20倍物镜拍摄宽场荧光图像。

　　

　　免疫荧光实验实例

　　

　　

　　人眼的小梁网细胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除载玻片中。F-肌动蛋白丝显示为绿色；细胞核被 DAPI（蓝色）染色。图片由中国香港香港理工大学视光学院的Samantha Shan提供。

　　

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